再说弗莱明到细菌部上任不久，就赶上第一次世界大战爆发，他立即上了前线，战士们伤口溃烂感染的痛苦给他留下极深的印象。战后他又回到圣玛丽医院细菌部，发誓要解决这个难题。
1928年，他集中力量研究葡萄球菌。这种可恶的东西，在显微镜下是黄色的，像一堆鱼子，让人一看就想呕吐，它就是导致伤口溃烂、生脓长疮和血液中毒的祸根。研究的办法照例是把这种细菌接种在培养皿上，给它一点儿培养液，让它生长，观察它的形态和生长规律。这是一件很枯燥又要很细心的工作，从列文虎克、巴斯德开始，便只有极富耐心的人才干得了这种事。
1928年的一天早晨，弗莱明换上工作服，像往常一样推门走进实验室，第一件事就是检查一晚上细菌的生长情况。他将那些小碟子似的培养皿一个个取出来，仔细观察，看到有一只培养皿上的黄色葡萄球菌比昨天少了一半。这是实验室里常有的事，细菌被别的菌污染后，培养皿上又会长出别的菌种。这一碟污染过的菌是不能用了，应该倒掉，重新培养。弗莱明站起身来，左手持碟，右手抓过一把镊子，“哧啷”一声刮在培养皿边上，就要将这些可恶又可怜的葡萄球菌刮入垃圾筒里去。但是，就在这镊子碰着培养皿边哧啷一响之际，弗莱明的手又缩了回来。他转念一想，我何不看看到底是什么讨厌的细菌总是在污染我的培养皿，破坏我的实验呢？
弗莱明这一转念不要紧，他可挽救了千万条生命。
弗莱明把碟子拿在手里仔细观察，被污染的地方好像长了一层绿霉。这不知是哪里飞来的一点儿绿霉菌的孢子落在了培养皿上，它便这样迅速地生长开来。更奇怪的是，这种绿色的菌十分强悍，竟将那些黄色葡萄球菌慢慢地吞噬掉了。按一般生物学家的解释，这是因为新菌夺去了培养皿上的养分，旧菌自然饿死。可是弗莱明不愿因袭这个传统观点，他想弄清这支“绿军”是怎样将“黄军”战败的。他在笔记上写道：“是什么引起我的惊异呢？就是在绿霉的周围，葡萄球菌被蚀化，以前它长得那样茂盛，现在只剩下了一点儿枯影。”
弗莱明未敢耽搁时机，他立即取来白金丝，挑了一点霉菌，放在皿上细心培养。这些霉菌在显微镜下很是好看，起初长出一点儿白色的绒毛，后来就变成一层绿色的“地毯”，而每一根就像浸在水里的毛笔，头上还有向四周张开的笔毛。他兴奋极了，立即召来两名助手说：“这种新菌生长力这样强，我看它很可能是葡萄球菌的死敌，它不只是和葡萄球菌争夺养料，而是自己分泌了一种汁液直接杀死了对方。”于是弗莱明吩咐助手将霉菌培养液仔细过滤。然后，他取过一只长满葡萄球菌的小碟，用白金丝挑了一滴过滤液滴入其中，几小时后，那些可恶的葡萄球菌竟消失得无影无踪了。
弗莱明高兴极了，他连连吩咐助手们赶快再制一点儿过滤液来。他们将过滤液稀释到各种浓度，试验于各种细菌。结果，当浓度为百分之一时就足以杀死链状球菌；到三百分之一时还能阻止葡萄球菌的生殖；到八百分之一时，还可杀灭肺炎球菌。这可真是一件从天而降的大喜事！那些疯狂作乱的病菌原来自有一种与它同样小的玩意儿可以轻而易举地对付它。病菌是可以由其他菌来对抗的，这便是抗菌素，弗莱明把这个人类发现的第一个抗菌素命名为青霉素。
