总起来说，波斯帝国与希腊世界的矛盾大约有三个方面：一是波斯人征服了色雷斯，严重威胁到希腊的安全；二是波斯人占领了赫勒斯滂地区，使希腊人进出黑海地区的通道受阻，虽然暂时波斯人未曾威胁希腊人，没说不让希腊的船只通过赫勒斯滂海峡，但一旦发生矛盾，波斯人就可以封锁海峡，那对希腊人来说影响就太大了，因为，希腊需要黑海地区的粮食、木材、奴隶及许多手工业原料，而黑海还是希腊许多城邦手工业产品的市场，因此，赫勒斯滂海峡对希腊人来说是生命攸关的；三是小亚希腊人是大陆希腊人的同族，小亚希腊人被波斯人征服，大陆希腊人不能不对他们的处境表示同情，等等。
作为战争导火线的是公元前500年的小亚希腊人的起义（或称米利都起义）。小亚的希腊人为什么起义？大概有这样几个原因：在政治上，虽然波斯征服者没有触动原来的地方自治制度，但毕竟这里的希腊人失去了先前的独立，即使人们的民族意识还不十分强烈，但不可能毫无感觉，后来那么多的希腊人参加起义就说明了这一点。那里原来的统治者也绝不会感到痛快。例如，米利都的僭主阿里斯塔哥拉的岳父希斯提亚，原来是米利都的僭主，后来被大流士俘虏到苏撒去，名义上是作为大流士的顾问，实际上是被软禁了起来，试问他能痛快吗？他们嘴上不说，但心里一定时刻想着赶走波斯人。后来小亚希腊人的起义是由他们鼓动起来的，就是一个证据。[2]
在经济上，小亚希腊人所在的行省按大流士的规定，每年要交纳400塔兰特白银作为赋税，此外还要交纳其他的苛捐杂税等，不能不说是沉重的负担。因此，包括手工业者、海员、商人在内的很多阶层的居民都参加了起义。
起义是怎么起来的呢？公元前500年，爱琴海上的昔克拉底斯群岛中的那克索斯岛上的民主派推翻了贵族派的统治，贵族派请求米利都的僭主阿里斯塔哥拉帮助他们恢复自己的政权。阿里斯塔哥拉想通过帮助那克索斯的贵族来扩大自己的统治范围并讨好波斯人。他向波斯帝国驻吕底亚总督阿尔塔弗伦提出共同远征那克索斯。但由于种种原因远征遭到失败，希罗多德说，阿里斯塔哥拉因担心受到波斯人的惩处，便决定起义反对波斯人。他在得到了他的岳父希斯提亚（他当时被软禁在波斯首都苏撒）的支持后，便鼓动米利都人起义反对波斯人的统治。[3]在一次会上，一个名叫狄奥尼修斯的人说：
伊奥尼亚人，我们当前的事态，正是处在我们是要作自由人，还是作奴隶，而且是逃亡的奴隶的千钧一发的决定关头了。因此如果你们同意忍受困苦，你们当前会尝到苦头的，但是你们却能够战胜你们的敌人而取得自由。但如果你们仍然这样闲散和不加整顿，我看就没有任何办法使你们不因背叛而受到国王的惩罚了……[4]
起义开始于公元前499年的秋天。起义开始前，米利都人在是否应起义的问题上有过争论。希罗多德说，虽然多数米利都人同意起义，但赫卡泰乌斯（历史学家）却不同意。他的主要理由是，波斯帝国太强大，“他向他们历数臣服于大流士的一切民族以及大流士的全部力量，因而劝他们最好不要对波斯的国王动武”。[5]但他的意见未被采纳，起义还是爆发了。起义得到了小亚希腊人的广泛支持，多数城邦加入了起义的队伍，大概也包括希罗多德的故乡哈里卡尔那索斯在内。
起义爆发后，阿里斯塔哥拉放弃了僭主的权力，将其交给了公民大会。公民大会选举阿里斯塔哥拉为起义的军事领导人，并号召所有的希腊人为反对波斯人的统治而斗争。那些被派去攻打那克索斯的舰队上的士兵在返回米利都后也积极参加了起义。
