1572年8月，安托万之子、纳瓦尔新王亨利与公主的婚礼在巴黎隆重举行，许多胡格诺显贵从南方赶来庆贺。凯瑟琳与吉斯集团头目、弗朗西斯之子亨利商定，趁机除掉科里尼。8月22日，科里尼在罗浮宫前被刺伤手臂，胡格诺群情激愤。凯瑟琳说服国王同意，要一举杀尽除亨利和新贡德亲王之外的所有胡格诺首领。8月24日是圣巴托罗缪节，以凌晨钟声为信号开始大屠杀，一天之内杀死胡格诺2000多人，包括科里尼。住在罗浮宫里的亨利和贡德亲王宣布改宗天主教，保全了性命。根据国王命令，莫城、奥尔良、卢昂、波尔多等地也开始大屠杀。据估计，全国被杀的胡格诺约2万人。
圣巴托罗缪节的枪声，粉碎了胡格诺依靠国王的梦想。南方的胡格诺举行暴动，胡格诺战争进入第二阶段（1572—1576年）。他们公开提出“反对暴君”的口号。一个署名攸尼乌斯·布鲁图斯的小册子《控诉暴君》里说：“只有上帝的统治不受限制，世上的君主则是上帝的附庸。如果这个附庸违反对人民的誓言，上帝可以推翻他。”[6]类似的小册子很多。国王派兵攻打拉罗舍尔，遇到顽强抵抗。1573年6月，查理九世只好签署《拉罗舍尔和约》，重申胡格诺信仰自由，战火暂时熄灭。
1574年5月30日，查理九世死，其弟安茹公爵继位，称亨利三世（1574—1589年在位）。王弟阿朗松公爵因夺权失败，倒向胡格诺。亨利三世派兵攻打，战火又起。德国巴拉丁伯爵派兵侵入香槟。凯瑟琳出面干预，劝说阿朗松公爵和平解决。1576年5月，亨利三世签署有利于胡格诺的《博利厄敕令》（又称《王弟和约》）。和约谴责圣巴托罗缪节大屠杀，规定胡格诺可在巴黎以外的所有城市礼拜，有权据有8个要塞。
吉斯集团对《博利厄敕令》十分不满，又加上亨利三世无子，而波旁家族的纳瓦尔的亨利却可能继承王位，他会像胡格诺那样走上反对瓦洛亚王朝的道路。于是，1576年6月，吉斯的亨利在西班牙和萨伏依的支持下，成立“天主教联盟”。这位亨利自称是加洛林王朝的后裔，其实是司马昭之心，路人皆知。同年同月，被软禁在罗浮宫的纳瓦尔的亨利逃离巴黎，回到南方，发誓要为科里尼将军等被害的胡格诺报仇。他很快重新赢得信任，成为胡格诺的领袖。在此期间，吉斯集团与胡格诺之间的冲突不断，胡格诺战争进入最后阶段（1576—1594年）。1577年9月，双方缔结《贝热拉克和约》，和约既要求解散天主教联盟，也限制《博利厄敕令》给予胡格诺的权利。
1584年6月，阿朗松公爵去世，纳瓦尔的亨利成为王位的唯一继承人。1585年，吉斯的亨利在西班牙支持下，重组天主教联盟，仍要继承亨利三世的王位。同年7月，亨利三世宣布参加天主教联盟，并利用联盟内部的矛盾戏剧性地改变其初衷，改名“王家联盟”，自任首领。为了安抚吉斯的亨利，1586年7月亨利三世签署《那慕尔敕令》，废除纳瓦尔的亨利的王位继承权和以前颁布的一切和解性法令，限令胡格诺6个月内改宗天主教，否则离开法国。吉斯的亨利另立“巴黎联盟”，策划新的反国王阴谋，于是瓦洛亚、波旁和吉斯三大家族的三位亨利展开争夺王位的内战，史称“三亨利之战”。
